Basically Assessed Subject : PRV-1 gen "Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera".


34 views
Uploaded on:
Description
Inhoud. Polycythemia Rubra Vera SymptomenDiagnose PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra VeraPRV-1 gen en RQ-PCRCritical AppraiselAnalytische performantiekarakteristiekenDiagnostische performantiekarakteristiekenKlinische impactOrganisatorische impactKostprijsDecision making.
Transcripts
Slide 1

Fundamentally Appraised Topic : PRV-1 gen "Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera" Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14-12-2004

Slide 2

Inhoud Polycythemia Rubra Vera Symptomen Diagnose PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera PRV-1 gen en RQ-PCR Critical Appraisel Analytische performantiekarakteristieken Diagnostische performantiekarakteristieken Klinische sway Organisatorische sway Kostprijs Decision making

Slide 3

1. Polycythemia Vera Rubra of Ziekte van Vacquez

Slide 4

Polycythemia Rubra Vera Myeloproliferatieve ziekte Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel Afwijkingen in de drie mergreeksen Klassiek onderscheidt men (FAB): Polycythemia Rubra Vera Essentiële trombocytose Myelofibrose Chronische myeloïde leukemie

Slide 5

Symptomen 6e – 7e levensdecade, Incidieus Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en mid-region Tromboseneiging (perifeer + centraal) Jeuk Plethora Splenomegalie Bloedingen (GI)

Slide 6

Diagnose (1) Verhoogde rode bloedcel massa Absolute of relatieve erytrocytosis? HTC > 56% ( ♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG) Hb > 16,5 g/dL (♀) of 18,5 g/dL (♂): major criterium (WHO) Heike L Pahl, Diagnostic ways to deal with polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

Slide 7

Diagnose (2) Primaire of secundaire polycytemie? Carboxyhemoglobine gehalte? UpToDate Online variant 12.2 (2004)

Slide 8

Diagnose (3) EPO measurement Relatief eenvoudig - CHU Sart Tilman Luik Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis Beenmergkweek : Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK\'s) Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosten-effectief Morfologisch onderzoek van het beenmerg : Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten Geen criterium voor diagnosestelling van PV

Slide 9

Diagnose (4) Histologisch onderzoek van beenmergbiopt : Kan analyze van PV bevestigen ↑ aantal grote megakaryocyten in bunches, proliferatie van de 3 mergreeksen met vooral proliferatie van de erytropoïese hyperplasie van gedilateerde sinussen Cytogenetische afwijkingen : Slechts in 10 – 20% afwijkend Bewijs klonale aandoening

Slide 10

Diagnose (5) Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000) WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

Slide 11

Diagnose – nieuwe testen (6) Verminderde expressie van de TPO receptor (c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten [Moliterno et al] Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen : lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten Overexpressie van PRV-1 mRNA

Slide 12

2. PRV-1 gen "Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera"

Slide 13

2.1. PRV-1 gen en RQ-PCR

Slide 14

PRV-1 gen? PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i.t.t. SE, CML, AML In fysiologische toestand expressie in het beenmerg perifeer bloed, geen beenmerg! PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA PRV-1 gen Behoort tot de uPAR/Ly6/CD39 receptoren Chromosoom 19 band locale q13.12-2 Overexpressie mogelijks entryway aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen Rol in de pathofysiologie van PV?

Slide 15

Principe ongoing PCR Oligo dT preliminary bindt mRNA RT maakt 1e streng cDNA aan RT heeft endo H aktiviteit Dubbelstrengs cDNA

Slide 16

Principe constant PCR Denaturatie = splitsen van ds cDNA (95°) Annealing = binden van de groundworks (60°) Extension = vormen van een complementaire cDNA-streng mbv Taq-polymerase (60°) R Q Real-time PCR: fluorofoor gelabelde test!

Slide 17

R Q Probe bestaat uit 5\' columnist mark en een 3\' quencher name Probe wordt afgebroken entryway de 5\' nuclease aktiviteit van het Taq-polymerase => fluorescentie ↑ Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds cDNA ketens Opnieuw denaturatie, strengthening,

Slide 18

R Q R Q expansion, denaturatie, tempering, … Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA-sequentie

Slide 19

Afbraak van de test => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde De CT-waarde ( c ycle t reshold) is pass on cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden

Slide 20

Standaardcurve (1) Met behulp van een plasmide : 4018 Kbp lang Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg) Plasmide transformatie naar E. coli DH5 α , dan amplificatie Plasmideconcentratie meten in het lysaat Lineariseren van het plasmide Dn concentratie geknipt plasmide meten M.b.v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen GUS ( ß-glucuronidase) : commerciële unit

Slide 21

Standaardcurve (2) Seriële standaardreeks: 10 3 kopieën/5µL 10 4 kopieën/5µL 10 5 kopieën/5µL Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t.o.v. CT-waarde Standaardcurve voor GUS Standaardcurve voor PRV-1 Elk staal (in triple): Aantal kopieën PRV-1 Aantal kopieën GUS => Ratio kopieën PRV-1/GUS

Slide 22

2.2. Examination

Slide 23

Clinical primary concern Kwantitatieve break down van PRV-1 mRNA expressie met behulp van \'ongoing polymerase chain response\' is nuttig bij de analyze van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis , gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële analyze tussen primaire en secundaire erytrocytosis .

Slide 24

1. Analytische performantiekarakteristieken Pre-analytische variabelen Perifeer bloed, EDTA-staal Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed operation PRV-1 overexpressie Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling Staalstabiliteit: RNA extractie/aanmaken van cDNA gebeurt best binnen de 24u

Slide 25

2. Analytische parameters intra-examine variatie: Elk staal wordt in triple uitgevoerd Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS proportion Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0,83% 1,27% voor PRV-1 0,39% voor GUS

Slide 26

between measure variatie : Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m.b.v. een plasmide Voor 5 runs: CV\'s van de CT\'s voor 1000, 10000 en 100000 kopieën/5µL

Slide 27

Accuraatheid (predisposition): afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang Vergelijking met EPO measurement (n = 16): Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100% Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte! Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/ - 105 €

Slide 28

Lineariteit : correlatiecoëfficiënt Binnen de range van 1 tot 1.10 6 : lineair verband tussen log cDNA en de CT waarden . Referentie range : ≥ 130: PV bevestigen! (TO DO) < 130: geen PV Analytische range : Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT\'s . Pivot time (TAT) : max. 1x/maand en min. 1x/2 maanden

Slide 29

Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen a.d.h.v. EPO measurements: 51 aanvragen in 2003 48 aanvragen in 2004 (jan-okt) 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%) Kwaliteitscontrole : doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen. IQC: Het plasmide met zijn verdunningen is een controle operation de verschillende stappen van de PCR Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(- 1/incline)- 1 EQC: (nabije?) toekomst

Slide 30

2. Diagnostische performantiekarakteristieken M. Bossuyt, "Towards complete and precise reporting of investigations of demonstrative exactness: The STARD activity." Clin. Science 2003;49:1,1-6

Slide 33

PV Niet-PV

Slide 34

Diagnostisch viewpoint : nut bij analyze PV (DD. demure/sec erytrocytosis) Evt. EPO dose en/of EEK\'s vervangen Cytologie levert geen meerwaarde operation in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte) Botboorbiopsies: richtinggevend cytogenetica: minderheid + Behandeling : interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie PRV-1 expressie: merker voor klinische respons? Wellbeing result : juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de result verbetert Prognose en follow-up :/3. Klinische sway

Slide 35

4. Organisatorische sway Impact in het ziekenhuis: Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/ - 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/manager Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de analyze ( http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html ) Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting) Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of rules? H. L. Pahl "Indicative ways to deal with polycythemia vera in 2004" Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4) \'European Leukemia Network\' zal binnen enkele maanden rules publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR examine Voorstel PVSG criteria verder aan te passen

Slide 36

Diagnose PV: A1 + A2 + A3 of A4 A1 + A2 + twee B\'s

Recommended
View more...