Dudas denuccidglnet.br Archivo Analytical Methodologies spanish v97 Sitio gdenucci .


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Dudas denucci@dglnet.com.br Archivo Analytical Methodologies spanish v97 .ppt Sitio www.gdenucci.com. El uso de LC-MS/MS en Estudios de Bioequivalencia. Gilberto De Nucci Unidad Analítica Cartesius Universidad de São Paulo, Brasil denucci@dglnet.com.br. Tópicos . La bioequivalencia
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Dudas denucci@dglnet.com.br Archivo Analytical Methodologies spanish v97 .ppt Sitio www.gdenucci.com

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El uso de LC-MS/MS en Estudios de Bioequivalencia Gilberto De Nucci Unidad Analítica Cartesius Universidad de São Paulo, Brasil denucci@dglnet.com.br

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Tópicos La bioequivalencia La espectrometría de masas La opción por un standard interno Los métodos de ionización La preparación de las muestras El experimento de supresión iónica Ejemplos prácticos Conclusión

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Bioequivalencia Dos formulaciones de la misma forma farmaceutica producen perfiles de biodisponibilidad equivalentes

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La biodisponibilidad puede ser medida a travez de la medida de: Concentración del principio activo o metabolito(s) en fluidos biológicos en función del tiempo. Excreción urinaria del principio activo o metabolito(s) em función del tiempo. Cualquier efecto farmacológico apropiado.

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Parámetros farmacocinéticos 8 6 4 2 0 C max Concentración t max 0 3 6 9 12 Horas

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Parámetros farmacocinéticos 8 6 4 2 0 Concentración AUC 0-12h 0 3 6 9 12 Horas

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Qué es la espectrometria de masas? Efectua la medida de masas (relación masa/carga – m/z ) Técnica analítica para: identificar de compuestos desconocidos elucidar estructuras y propiedades químicas cuantificación substancias químicas Apropiado para detección de concentraciones muy pequeñas (tipicamente 10 - 12 - 10 - 15 moles)

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Cómo el espectrómetro de masas funciona?

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La disposición del espectrómetro de masas de triple cuadrupolo

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Espectrometria de masas - Métodos de ionización Impacto de Electrones (EI) Ionización Química (CI) Ionización a Presión Atmosférica (API) Ionización por ElectroSpray (ESI) Ionización Química a Presión Atmosférica (APcI) Ionización por desorción em matriz assistida por rayos laser (MALDI)

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Por qué usar API-MS? Cubre una amplia gama de peso sub-atomic Compatible con gran parte de los compuestos conocidos Diversos tipos de interfaces pueden ser utilizadas (inyección en flujo, HPLC, eletroforesis capilar) Robusto y fácil de usar

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Tipos de ionización a presión atmosférica (API-MS) Electrospray (ESI) : utiliza campos eléctricos para generar gotas cargadas que se tansforman en splash. Puede ser positivo (ES+) o negativo (ES-). APcI : donde el disolvente actua como gas ionizante APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization) : Una Lampara de Kriptonio deliver luz UV que ioniza los analitos o dopantes con subsecuente reacción en fase de gas

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Requisitos para los standard interno (I.S.) Estructura química comparable (Análogos) el analito y el I.S. devem poseer los mismos grupos funcionales atención particular a la fase de extracción las condiciones de ionización no pueden ser muuy diferentes Isótopos deuterados Se trata del analito marcado isotopicamente Ni siempre está disponible comercialmente

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Tipos de extracción de las muestras Líquido/Líquido dos fases (acuosa/orgánica) Más rápida Más barata Precipitación de proteinas Muy basic Rápida Muestras más "sucias" SPE (Extracción en fase sólida) Cartuchos de extracción Facilidad para la autmotización Más cara

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Procedimiento típico para las extracciones Líquido/Líquido

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Procedimiento típico para las extracciones en fase sólida (SPE) Adicione las muestras en los tubos de vidrio; Coloque la cantidad de I.S. e agite en vortex por 10 seg.; Aplique las muestras a los cartuchos de SPE (previamente pre-condicionados con metanol y agua), usando una presión positiva; Lave los cartuchos (en general usando água); Aplicar presión positva para asegurar que los cartuchos queden secos; El extracto é posteriormente eluido de los cartuchos usando un eluente apropiado y recogerlo en tubos de vidrio; Resuspender com una solución apropiada e transferirlas en los viales de HPLC;

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Liquido/Liquido Fluoxetina Fluconazol Captopril Omeprazol Paroxetina Diazepam Bromazepam Midazolam Nimodipino Amlodipina SPE Cefalexina Cefaclor Amoxicilina Didanosina Acyclovir Losartan Enalapril Lisinopril Algunos ejemplos de uso en estudios de bioequivalenccia Precipitación de proteinas Metil-DOPA

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Supresion iónica Supresión de la señal en el espectrómetro de masas Causada por cualquier interferencia (e.g. deals, proteinas, and so on.) Extracción no específica Los efectos de la preparación de muestras en el proceso de ionización devem ser evaluadas

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Experimento de supresión iónica Montaje

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Experimento de supresión iónica Bomba de infusión: una conc. standard de una mezcla de analito/IS (por ejemplo 50 ug/mL a 50 uL.min) Bomba de HPLC: el flujo de fase movil especificado para el ensayo Extrair e inyectar en el sistem así dispuesto una muestra no contaminada Observe lo que pasa con la señal (línea de base)

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100 MRM of 2 Channels ES+ % 247 > 204.2 - 15 100 237 > 194.2 % - 15 Time 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Experimento de supresión iónica Resultado típico

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2.32 100 MRM of 2 Channels ES+ % 247 > 204.2 - 15 2.37 100 237 > 194.2 % - 15 Time 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Experimento de supresión iónica Cromatograma de la muestra

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Estudios de bioequivalencia: Ejemplos prácticos

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Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad Analítica Cartesius Micromass Quattro II (desde 1997) Quattro LC (desde 2000) Quattro Ultima (desde 2001) Quattro Micro (desde 2003) Sciex/Applied Biosystems API 2000 (desde 2002)

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Sistemas de LC-MS/MS de la Unidad de Investigación Galeno Micromass Q-TOF Ultima (desde 2002) Sciex/Applied Biosystems (desde 2003) 3 equipos API 4000 1 equipo API 3000

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Estructuras químicas Captopril y Enalapril (IS)

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Método analítico para determinación de Captopril add up to Extracción: Líquido/Líquido usando éter/diclorometano ( 70/30, v/v ) con tratamiento foremost usando ditiotreitol Columna analítica: Jones Genesis C 18 , 4um ( 150x4.6 mm id) Fase movil: Isocratica [agua/metanol (40/60; v/v) + 5 mM acetato de amonio + 13 mM ácido trifuoroacético] Flujo: 1.0 mL/min Standard interno: Enalapril Tiempos de retención: 2.6 min (Captopril – MRM 217.2 - > 115.9) 3.6 min. (I.S. - Enalapril – MRM 377.4 - > 234.0) Tiempo add up to de HPLC: 6.0 min

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Método analítico para determinación de Captopril add up to Condiciones MS: ES+ Sistema: Micromass Quattro II LLOQ : 0.0100 µ g/ml CV% = 12.9% Accuracy = 99.3% Inter Batch Precision (CV%) LLOQ = 11.1% Arriba del LLOQ = < 6.6% Inter Batch Accuracy (%) LLOQ = 97.1% Arriba del LLOQ > 92.7%

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Captopril 10 ng/mL in plasma 3.65 100 8533 MRM of 2 Channels ES+ 377.4 > 234 % 0 2.56 100 275 MRM of 2 Channels ES+ 217.2 > 115.9 % 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Cromatograma del "LOQ"

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Estructuras químicas Midazolam, 1-OH Mmidazolam y Alprazolam (IS)

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Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam Extracción: Líquido/Líquido usando eter/diclorometano ( 70/30, v/v ) Columna analítica: Alltech Prevail C 8 , 5um ( 150x4.6 mm id) Fase movil: Isocratica [agua/metanol (35/65; v/v) + 12 mM ácido fórmico] Flujo: 1.5 mL/min Standard interno: Alprazolam Tiempo de retención: 2.0 min (Midazolam – MRM 326.2 - > 281.4) 2.2 min (1-OH Midazolam – MRM 342.3 - > 203.3) 3.3 min. (I.S. - Alprazolam – MRM 309.3 - > 281.4) Tiemppo add up to de HPLC: 4.5 min

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Método analítico para determinación de Midazolam/1-OH Midazolam Condiciones de MS: ES+ Sistema: Micromass Quattro Ultima LLOQ : 0.500 ng/ml (para ambos analitos) CV% = 12.7% (Parent); 18.7% (Metabolito) Accuracy = 85.9% (Parent); 98.9% (Metabolito) Inter Batch Precision (CV%) LLOQ = 10.9% (Parent); 15.9 (Metabolito) Arriba del LLOQ = < 6.0% (Parent); <9.5% (Metabolito) Inter Batch Accuracy (%) LLOQ = 111.3% (Parent); 103.2 (Metabolito) Arriba del LLOQ > 96.4% (Parent); >92.1%

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QL-Midazolam 0.50 ng/mL + 1-OH-Midazolam in plasma MRM of 3 Channels ES+ 2.19;233 100 342.3 > 203.3 % - 15 MRM of 3 Channels ES+ 100 2.00;1592 326.2 > 291.4 % - 15 3.30 MRM of 3 Channels ES+ 100 21577 309.3 > 281.4 % Time - 15 1.00 2.00 3.00 4.00 Cromatograma del "LOQ"

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Estructuras químicas Pantoprazol y Lansoprazol (IS)

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Método analítico para determinación de Pantoprazol Sample Extraction: Líquido/Líquido usando eter/diclorometano ( 70/30, v/v ) Columna analítica: Jones Genesis C 8 , 4um ( 150x4.6 mm id) Fase movil: Isocratica [acetonitrilo/agua/metanol (57/25/18; v/v) + 20 mM acetato de amonio + 10 mM ácido acético] Flujo: 0.7 mL/min Standard interno: Lansoprazol Tiempos de retención: 3.4 min (Pantoprazole – MRM 383.4 - > 199.6) 3.7 min. (I.S. - Lansoprazole – MRM 369.9 - > 251.6) Tiempo add up to de HPLC: 4.5 min

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Método analítico para determinación de Pantoprazol Condiciones de MS: ES+ Sistema: Micromass Quattro II LLOQ : 5.00 ng/ml CV% = 13.9% Accuracy = 93.3% Inter Batch Precision (CV%) LLOQ = 14.0% Arriba del LLOQ = < 4.7% Inter Batch Accuracy (%) LLOQ = 89.4% Arriba del LLOQ > 97.1%

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MRM of 2 Channels ES+ Pantoprazol 5.00ng/mL in Plasma extr 369.95 > 251.58 3.67;42887 100 % 0 MRM of 2 Channels ES+ 3.40;273 100 383.84 > 199.63 % 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 Cromatograma del "LOQ"

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Estructuras químicas Hidroclorotiazida y Clortalidona (IS)

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Método analítico para determinación de Hidroclorotiazida Extracción: Líquido/Líquido usando eter/diclorometano ( 60/40, v/v ) Columna: J

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